利用新型DNDF7和携带LoxP位点的LPL4质粒快速构建S-Sox5基因打靶载体
【出 处】:《
中国男科学杂志
》
CAS
CSCD
2015年第0卷第9期 7-13页,共7页
【作 者】:
刘晙玭
[1] ;
汪智琼
[2] ;
平光伦
[1] ;
石玉琴
[1] ;
张玲
[1] ;
张志兵
[1,3]
【摘 要】
目的体外实验已证实S-SOX5蛋白转录调节运动纤毛基因Spag6,为进一步探索其在体内的作用,拟构建S-Sox5基因的敲除载体。方法利用新型DNDF-7和携带LoxP位点的LPL4载体,选择S-Sox5基因第1外显子作为条件性敲除目的片段,SV129系Es细胞DNA为模板分步扩增包括S-Sox5第1外显子的中间段(middle piece),上游同源左臂4.8kb(upper arm)及下游同源右臂2.5kb(down arm)的基因片段;构建upper-arm-DNDF7、down-arm-DNDF7和middle-piece-LPL4质粒,将middle-piece-LPL4的酶切产物LoxP—middle—piece.LoxP和down-arm-DNDF7酶切产物相连,形成携带LoxP位点的middle-down-arms-DNDF7重组质粒,该质粒与upper-arm-DNDF7酶切产物相连,获得S-Sox5基因打靶载体。结果经酶切鉴定及测序证实,构建的upper-arm-DNDF7、middle-piece-LPL4、down-arm-DNDF7重组质粒和S-Sox5基因打靶载体结构正确,与设计相符。结论成功构建小鼠S-Sox5条件基因打靶载体,为进一步建立S-Sox5条件敲除小鼠,在体内研究其功能打下基础。
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