穿膜肽EGFP的构建及其对人成熟精子的穿膜活性鉴定
【出 处】:《
中国男科学杂志
》
CAS
CSCD
2014年第0卷第11期 8-13页,共6页
【作 者】:
陈厚仰
[1] ;
仇克清
[2] ;
孙捷
[1] ;
黄志辉
[1] ;
应志伟
[1] ;
吴丽萍
[1] ;
曾韩
[1] ;
伍琼芳
[1]
【摘 要】
目的:构建穿膜肽TAT与EGFP融合蛋白的原核表达系统,研究该融合蛋白对人成熟精子的穿膜作用和对精子运动参数的影响。方法以pEGFP-N1载体为模板,设计N端和C端含有TAT序列的引物,用PCR技术扩增TAT-EGFP和EGFP-TAT基因,扩增产物插入载体 pET28a,构建成重组质粒pET28a-TAT-EGFP和pET28a-EGFP-TAT。将重组质粒转入大肠杆菌DE3中,IPTG诱导TAT-EGFP和EGFP-TAT融合蛋白表达。表达产物经Ni-NTA亲和层析柱纯化后SDS-PAGE电泳鉴定。将融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT分别加入正常人精子中孵育,荧光显微镜观察融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT穿膜情况。结果成功构建了高表达重组质粒pET28a-TAT-EGFP和pET28a-EGFP-TAT,纯化了分子质量约为32 kD的融合蛋白 TAT-EGFP和EGFP-TAT。融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT在正常人成熟精子中有穿膜作用。不同浓度的融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT对正常人成熟精子存活率及运动参数无明显影响。结论通过对融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT表达纯化及活性分析,证实穿膜肽TAT在精子中的跨膜转运作用,为将来精子研究提供了实验基础。
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